核医学 · 知识点7：体外分析技术
考试重点整理（含图理解版）— 基于授课 PPT（23页）整理
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★★★ 必背：RIA原理、B/F、B%、B/B₀、标准曲线、RIA vs IRMA
★★ 理解：试剂盒组成、分离方法、实验性能、非放射性免疫技术
一、概述：体外标记免疫分析的发展（PPT P2）
体外标记免疫分析的发展时间线（依据PPT重绘）
• 20世纪60年代：Berson 和 Yalow，放射免疫分析（RIA）；PPT标注“诺贝尔奖”。
• 20世纪70年代：Engvall 和 Wecman（PPT原文），酶标记免疫分析（EIA）。
• 20世纪80年代：时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）。
• 随后出现化学发光免疫分析（CLIA）、电化学发光免疫分析（ECLIA）、微粒体发光免疫分析（MLEIA）。
二、放射免疫分析 RIA：核心原理（PPT P3）
• RIA 的本质是竞争性抗原-抗体结合反应：待测抗原 Ag 与标记抗原 *Ag 竞争有限量的特异性抗体 Ab。
• 竞争平衡后，将抗体结合部分 B（Bound）与游离部分 F（Free）分开并测量放射性。
• 待测 Ag 越多，与 Ab 结合的 *Ag 越少，因此 B%、B/B₀ 等结合指标下降。
图1 RIA竞争结合原理示意（依据PPT原理重绘）
易错提醒：RIA 是“竞争性”分析；后面的 IRMA 是“非竞争性”分析，二者标准曲线方向相反。
三、RIA 试剂盒组成（PPT P4）
组成 | PPT要求/作用 |
|---|---|
抗体（结合剂） | 高亲和力、高特异性、高滴度 |
标记抗原 | 125I；放化纯；长半衰期；标记后不改变抗原活性 |
标准品 | 与被测物为同一物质；定量精确；放化纯高 |
B 与 F 分离技术 | 将结合部分与游离部分分开 |
放射性测量仪 | 测定 B 或 F 的放射性 |
易错提醒：125I 在本PPT中用于“标记抗原”；IRMA 中则用 125I 标记“抗体”。
四、RIA 实验操作步骤（PPT P5–14）
图2 RIA实验操作流程（依据PPT步骤重绘）
• 1）配制一系列已知浓度的标准抗原 Ag 反应管，并设置待测样品管。
• 2）各管加入固定量 *Ag 和 Ab。
• 3）温育，待竞争结合达到平衡。
• 4）分离 B（Bound）与 F（Free）。
• 5）用放射性探测器测 *Ag-Ab 的放射性（B）或游离 *Ag 的放射性（F）。
• 6）计算 B% 或 B/B₀%，绘制标准曲线。
• 7）在相同条件下测待测样品，由标准曲线查出 Ag 浓度。
五、B、F、B₀ 与标准曲线：考试最容易出题（PPT P9–14）
• B = Bound：标记抗原与抗体形成复合物的结合部分。
• F = Free：游离的标记抗原部分。
• B% = B / (B + F) × 100%。
• B₀：不含待测 Ag（Ag=0）时的结合率；此时 *Ag-Ab 的结合率最大，所以 B₀ 是最大结合率。
• 标准曲线可用 B% 或 B/B₀ 为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标。
图3 PPT第12–13页标准曲线趋势重绘（仅表示趋势）
易错提醒：Ag 浓度 ↑：B% / B/B₀ ↓；F% ↑；B/F ↓。选择题常把“正负相关”反着考。
六、B 与 F 的分离方法（PPT P15）
• 液相分离技术：双抗体沉淀法。
• 液相分离技术：聚乙二醇法（PEG）。
• 液相分离技术：葡萄球菌 A 蛋白（SPA）沉淀法。
• 液相分离技术：活性炭吸附法。
• 固相分离技术。
易错提醒：这部分适合出“下列哪项不属于液相分离技术”或配对题。
七、实验操作与分析性能（PPT P16）
• 实验操作五步：加样 → 温育 → 分离 → 测定放射性 → 数据处理。
• 实验分析性能（稳定性）包括：精密度、灵敏度、准确度。
• 质量控制。
八、免疫放射分析法 IRMA（PPT P17–19）
• 1968年由 Miles 和 Hales 建立免疫放射分析法（IRMA）。
• IRMA 以 125I 标记抗体作示踪剂，与非标记抗原（待测样品或标准品）形成复合物；除去多余游离抗体后，测量复合物放射性。
• 属于非竞争性抗原-抗体结合反应。
• 抗原-抗体复合物的量与所加非标记抗原量呈正相关。
• PPT列出的基本方法：双抗体夹心法、标记第三抗体法、其他方法。
• PPT提示：IRMA 非特异结合对低剂量区影响大，对分离条件要求非常严格。
图4 RIA 与 IRMA 核心关系示意（依据PPT重绘）
九、RIA 与 IRMA 对比表（PPT P20）
比较项目 | RIA | IRMA |
|---|---|---|
标记物 | 抗原 | 抗体 |
原理 | 竞争性结合 | 非竞争性结合 |
抗体量 | 限量 | 过量 |
标准曲线 | 负相关 | 正相关 |
达到平衡速度 | 慢 | 快 |
可测范围 | 窄 | 宽 |
应用对象 | 大分子、小分子 | 大分子 |
易错提醒：最常考的四组：标记物（抗原 vs 抗体）、竞争 vs 非竞争、限量 vs 过量、负相关 vs 正相关。
十、非放射性标记免疫技术（PPT P21）
• 酶标记免疫分析技术：酶联免疫吸附分析法（ELISA）。
• 化学发光分析法：PPT描述为化学反应释放自由能，使体系进入激发态，退激时释放光子。
• 时间荧光免疫分析。
• PPT还列出“RIA 与非放射性标记免疫分析法的比较”。
十一、体外标记免疫分析的临床应用（PPT P22）
• 蛋白质和肽类激素。
• 病原体抗原。
• 肿瘤标记物。
十二、考前速记：20个高频点
序号 | 考点 | 一句话答案 |
|---|---|---|
1 | RIA原理 | Ag 与 *Ag 竞争限量 Ab |
2 | RIA标记物 | 标记抗原 *Ag；PPT用 125I |
3 | RIA抗体量 | 限量 |
4 | RIA关系 | Ag↑ → B% / B/B₀↓ |
5 | B | Bound，结合部分 |
6 | F | Free，游离部分 |
7 | B% | B/(B+F)×100% |
8 | B₀ | Ag=0时最大结合率 |
9 | RIA标准曲线 | 负相关 |
10 | RIA五步 | 加样→温育→分离→测放射性→数据处理 |
11 | 液相分离 | 双抗体、PEG、SPA、活性炭 |
12 | 分析性能 | 精密度、灵敏度、准确度 |
13 | IRMA标记物 | 125I标记抗体 |
14 | IRMA原理 | 非竞争性结合 |
15 | IRMA抗体量 | 过量 |
16 | IRMA标准曲线 | 正相关 |
17 | IRMA速度 | 比RIA快 |
18 | IRMA范围 | 比RIA宽 |
19 | RIA应用对象 | 大分子、小分子 |
20 | IRMA应用对象 | 大分子 |
十三、易混淆与陷阱题
易混点 | 正确记法 |
|---|---|
RIA vs IRMA 标记谁 | RIA 标记抗原；IRMA 标记抗体。 |
RIA vs IRMA 反应类型 | RIA 竞争性；IRMA 非竞争性。 |
抗体用量 | RIA 限量；IRMA 过量。 |
标准曲线方向 | RIA 负相关；IRMA 正相关。 |
B₀含义 | 不是“0结合”，而是 Ag=0 时标记抗原的最大结合率。 |
Ag增多时B变化 | 待测 Ag 越多，*Ag 与 Ab 结合越少，所以 B% 降低。 |
B/F分离 | 双抗体、PEG、SPA、活性炭均在PPT液相分离技术中。 |
十四、可能的名词解释 / 简答题模板
1. 简述RIA的基本原理
待测抗原 Ag 与固定量标记抗原 *Ag 竞争限量特异性抗体 Ab。竞争达到平衡后分离结合部分 B 与游离部分 F，测定放射性并计算 B% 或 B/B₀，以标准曲线求出待测样品 Ag 浓度。
2. 简述RIA实验操作步骤
配制标准管及待测管 → 加入固定量 *Ag、Ab → 温育竞争结合 → 分离 B/F → 测定放射性 → 计算 B%或B/B₀ → 绘制标准曲线 → 查出待测样品浓度。
3. B₀是什么
B₀是不含待测 Ag（Ag=0）时的结合率，此时 *Ag-Ab 的结合率最大，因此是最大结合率。
4. 简述IRMA基本原理
以 125I 标记抗体作示踪剂，与非标记抗原形成复合物，除去多余游离抗体后测量复合物放射性；属于非竞争性反应，复合物量与待测抗原量正相关。
5. 比较RIA与IRMA
RIA：标记抗原、竞争性、抗体限量、标准曲线负相关、平衡慢、范围窄、可测大/小分子；IRMA：标记抗体、非竞争性、抗体过量、标准曲线正相关、平衡快、范围宽、主要测大分子。
最后5分钟冲刺页：只背这8组
★★★ RIA = Ag 与 *Ag 竞争限量 Ab。 | ★★★ Ag↑ → *Ag-Ab↓ → B%、B/B₀↓ → RIA标准曲线负相关。 |
|---|---|
★★★ B%=B/(B+F)×100%；B₀=Ag为0时最大结合率。 | ★★★ RIA五步：加样 → 温育 → 分离 → 测放射性 → 数据处理。 |
★★★ 液相分离：双抗体、PEG、SPA、活性炭。 | ★★★ IRMA：125I标记抗体，非竞争，抗体过量，正相关。 |
★★★ RIA vs IRMA：抗原/抗体；竞争/非竞争；限量/过量；负相关/正相关。 | ★★★ 临床应用：蛋白质和肽类激素、病原体抗原、肿瘤标记物。 |
最容易反着考：RIA负相关；IRMA正相关。